The current U.S. Department of Agriculture (USDA)–validated real-time reverse transcription–polymerase chain reaction (rRT-PCR) assay designed to detect the matrix gene of avian paramyxovirus serotype-1 (APMV-1) is the primary screening assay used in the United States. It has previously been shown to be unable to consistently detect all members of class I APMV-1. Diagnostic testing relies on rRT-PCR to quickly detect APMV-1 in wild birds, backyard flocks, live bird markets, commercial poultry, and for export testing. Limitations of the current USDA assay have raised concerns about the potential for some strains of APMV-1 to remain undetected by the primary screening assay. Mismatches in the probe were shown to cause a loss in template binding efficiency, resulting in lack of detection by the assay. Here, we describe the development and analytical validation of a new rRT-PCR assay designed to target a highly conserved region of the matrix gene across a wide range of APMV-1 strains. Limit of detection testing revealed a 3 log₁₀ decrease in sensitivity for one low-virulence strain when compared to the USDA validated assay. Conversely, the assay showed increased sensitivity for a class I isolate and two virulent strains of APMV-1 that were not detected by the USDA-validated assay. The new assay also demonstrated a high degree of specificity by the lack of detection of 43 non–APMV-1 viruses.

Ensayo de rRT-PCR para detectar el gene de la matriz de una amplia gama de cepas de paramixovirus aviares serotipo I.

El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), validó un método de transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (rRT-PCR) que fue diseñado para detectar el gene de la matriz de los paramixovirus aviares serotipo 1 (APMV-1) el cual es la prueba de detección primaria utilizada en los Estados Unidos. Previamente, se ha demostrado que este método es incapaz de detectar de forma consistente a todos los miembros de la clase I de los APMV-1. Las pruebas de diagnóstico se basan en la rRT-PCR para detectar rápidamente la presencia de APMV-1 en las aves silvestres, aves de traspatio, en los mercados de aves vivas, en la avicultura comercial, y en las pruebas requeridas para la exportación. Las limitaciones del ensayo actual del USDA han generado interés por la posibilidad de que algunas cepas del APMV-1 puedan permanecer sin ser detectadas por el ensayo de diagnóstico primario. Se demostró que algunas disparidades en la sonda causaron una disminución en la eficiencia en la hibridación a la secuencia de ADN blanco, lo que resulta en una disminución en la detección mediante dicho ensayo. A continuación, se describe el desarrollo y la validación analítica de un nuevo método de rRT-PCR que fue diseñado para tener como blanco a una región altamente conservada del gene de la matriz de una amplia gama de cepas de APMV-1. El límite de detección de la prueba mostró una disminución de 3 log₁₀ de la sensibilidad para detectar una cepa de baja virulencia en comparación con el ensayo validado por el USDA. Sin embargo, este nuevo ensayo mostró una mayor sensibilidad para detectar un aislamiento Clase I y dos cepas virulentas de APMV-1 que no fueron detectados por el ensayo validado por el USDA. El nuevo ensayo también demostró un alto grado de especificidad porque no detectó 43 virus distintos al APMV-1.