Accurate sex determination of an individual is essential for understanding the ecology of a species and to implement effective conservation measures. Molecular sexing is proving to be an effective tool to determine the sex ratio of difficult-to-sex species as well as for establishing breeding pairs in ex situ conservation programmes. In the last few decades, a putatively universal set of primers, based on the so-called intron A of the CHD1 gene, has been used to sex birds through PCR. Nevertheless, several issues have been reported in several taxa for which more specific alternative protocols are needed. In this paper we present a new pair of markers based on the so-called intron E of the CHD1 gene and designed for sexing difficult-to-sex Old World bunting Emberiza spp. individuals. This method was then used for supporting an ongoing Eastern Iberian Reed Bunting Emberiza schoeniclus witherbyi breeding programme and to estimate, for the first time, the sex ratio of this critically endangered passerine. Newly designed primers allowed for more rapid and accurate sex determination compared to other previously developed markers tested here, thanks to larger size differences between CHD1W and CHD1Z PCR products and lower allelic drop-out frequency. Our results suggest no significant sex bias in the Eastern Iberian Reed Bunting resident population (male:female ratio 0.8:1), as opposed to strongly female-biased estimates (up to male:female ratio 0.33:1) previously recorded in Spain for wintering populations. Differences in sex ratio estimates between resident and wintering populations could arise from a latitudinal sex segregation in Reed Buntings due to differential migration, and highlight the importance of using resident populations to obtain key demographic parameters. Future work should focus on sampling resident populations to better characterise local variations in sex ratio, to obtain relevant data for the management of threatened subspecies.—Alambiaga, I., Monrós, J.S. & Palero, F. (2024). New primers for sexing juvenile buntings and to assist ex-situ conservation of endangered Eastern Iberian Reed Bunting Emberiza schoeniclus witherbyi populations. Ardeola, 71: 119-130.

La determinación precisa del sexo de un individuo es esencial para comprender la ecología de una especie y poder aplicar medidas de conservación eficaces. El sexado mediante técnicas moleculares proporciona una herramienta esencial en especies difíciles de sexar para determinar la proporción de sexos de poblaciones salvajes, así como para establecer parejas reproductoras en programas de conservación ex situ. En las últimas décadas, para el sexado de aves mediante PCR se ha utilizado ampliamente un par de cebadores, supuestamente universales, basados en el denominado intrón A del gen CHD1. No obstante, se han constatado problemas en su aplicación en diferentes taxones para los que se precisan protocolos alternativos más específicos. En este trabajo presentamos un nuevo par de cebadores basados en el intrón E del gen CHD1 diseñados para sexar muestras de escribanos Emberiza spp. de difícil sexado molecular. Este método ha sido utilizado para dar soporte a un programa de cría en cautividad del escribano palustre iberoriental Emberiza schoeniclus witherbyi y para estimar, por primera vez, la proporción de sexos en este paseriforme palustre en peligro de extinción. Los nuevos cebadores permitieron un sexado más eficaz que otros marcadores desarrollados previamente debido a las mayores diferencias de tamaño entre los productos de PCR de los alelos CHD1W y CHD1Z, y a la menor frecuencia en la presencia de alelos nulos. Nuestros resultados indican que no hay un sesgo sexual significativo en la población del residente escribano palustre iberoriental (proporción macho:hembra de 0,8:1), en contraste a las estimaciones fuertemente sesgadas hacia las hembras (hasta proporción macho:hembra de 0,33:1) previamente registradas en España para las poblaciones invernantes. Las diferencias en la proporción de sexos entre las poblaciones residentes e invernantes podrían deberse a una segregación latitudinal por sexos de la especie debido a la migración diferencial, y ponen de manifiesto la importancia de utilizar poblaciones residentes para conocer parámetros demográficos esenciales. Futuros trabajos deberían centrarse en el muestreo de poblaciones residentes para caracterizar mejor las variaciones locales en la proporción de sexos y obtener así información relevante para la gestión de subespecies amenazadas.—Alambiaga, I., Monrós, J.S. y Palero, F. (2024). Nuevos cebadores para sexar juveniles de escribano y asistir a la conservación ex-situ de poblaciones amenazadas del escribano palustre iberoriental Emberiza schoeniclus witherbyi. Ardeola, 71: 119-130.